Izvorni kôd stranice Nasumično sekvenciranje

{{genetika bočni stubac}}
U [[genetika|genetici]], '''nasumično sekvenciranje'''  ili '''sačmarično sekvenciranje''' je metod koji se koristi za [[sekvenciranje]] nasumične [[DNK]] niti. Ime je dobilo po analogiji sa brzo širećim, kvazi-slučajnim [[grupiranje hitaca|grupiranjem hitaca]] [[sačmarica]].
 
[[Sangerovsko sekvenciranje|Metod prekida lanca]] kod [[DNK sekvenciranje|sekvenciranja DNK]] ("Sangerovsko sekvenciranje") može se koristiti samo za kratke lance DNK od 100 do 1000 [[bazni par|baznih parova]]. Zbog ovog ograničenja veličine, duže sekvence se dijele na manje fragmente koji se mogu zasebno sekvencirati, a ove sekvence se [[sklapanje sekvence|sastavljaju]] da daju ukupnu sekvencu.
 
U sekvenciranju ovog tipa,<ref name="Staden">{{cite journal
  | last = Staden
  | first = R
  | title = A strategy of DNA sequencing employing computer programs
  | journal = Nucleic Acids Research
  | volume = 6
  | issue = 70
  | pages = 2601–10
  | date = 1979
  | pmid =  461197
  | doi = 10.1093/nar/6.7.2601
  | pmc = 327874}}</ref><ref>{{cite journal
  | last = Anderson
  | first = S
  | title = Shotgun DNA sequencing using cloned DNase I-generated fragments
  | journal = Nucleic Acids Research
  | volume = 9
  | issue = 13
  | pages = 3015–27
  | date = 1981
  | pmid = 6269069
  | doi = 10.1093/nar/9.13.3015
  | pmc = 327328}}</ref> DNK je nasumično razbijena na brojne male segmente, koji se sekvenciraju korištenjem metoda prekida lanca kako bi se dobila ''čitanja''. Višestruka preklapanja čitanja za ciljnu DNK dobijaju se izvođenjem nekoliko rundi ove fragmentacije i sekvenciranja. Računarski programi zatim koriste preklapajuće krajeve različitih čitanja kako bi ih spojili u kontinuiranu sekvencu.<ref name="Staden" />
 
Sačmarična sekvenciranje bila je jedna od prekursorskih tehnologija koja je bila odgovorna za omogućavanje [[sekvenciranje cijelog genoma|sekvenciranja cijelog genoma]].
 
==Primjer==
Na primjer, uzmite u obzir sljedeća dva kruga sačmarice:
{| class="wikitable"
|-
! Lanac
! Sekvenca
|-
| Original| <code><big>AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA</big></code>
|-
| Prva nasumična sekvenca
| <code><big>AGCATGCTGCAGTCATGCT-------</big></code><br/><code><big>-------------------TAGGCTA</big></code>
|-
| Druga nasumična sekvenca
| <code><big>AGCATG--------------------</big></code><br/><code><big>------CTGCAGTCATGCTTAGGCTA</big></code>
|-
| Rekonstrukcija
| <code><big>AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA</big></code>
|}
U ovom krajnje pojednostavljenom primjeru, nijedno od očitavanja ne pokriva cijelu dužinu originalne sekvence, ali četiri čitanja se mogu sklopiti u originalni niz, korištenjem preklapanja njihovih krajeva, kako bi se poravnali i poredali. U stvarnosti, ovaj proces koristi ogromne količine informacija koje su pune nejasnoća i grešaka u sekvenciranju. Sastavljanje složenih [[genom]]a dodatno je komplikovano velikim brojem [[ponavljajuća sekvenca (DNK)|ponavljajućih sekvenci]], što znači da bi slična kratka čitanja mogla doći iz potpuno različitih dijelova sekvence.
 
Mnoga preklapanja čitanja za svaki segment originalne DNK su neophodna da bi se prevladale ove poteškoće i precizno sastavila sekvenca. Naprimjer, da bi se završio [[Projekt ljudskog genoma]], većina ljudskog genoma je sekvencirana pri 12X ili većoj ''pokrivenosti''; odnosno svaka baza u konačnoj sekvenci bila je prisutna u prosjeku u 12 različitih čitanja. Čak i tako, sadašnji metodi nisu uspjeli izolirati ili sastaviti pouzdanu sekvencu za otprilike 1% ([[euhromatin|eukromatinskog]]) ljudskog genoma, od 2004.<ref name=HGS2004>{{cite journal|last1=Human Genome Sequencing Consortium|first1=International|title=Finishing the euchromatic sequence of the human genome|journal=[[Nature]]|date=21. 10. 2004|volume=431|issue=7011|pages=931–945|doi=10.1038/nature03001|pmid=15496913|bibcode=2004Natur.431..931H|doi-access=free}}</ref>

==Sekvenciranje cijelog genoma==
 
=== Historija ===
Sekvenciranje cijelog genoma za male genome (od 4000 do 7000 parova baza) prvi put je predloženo 1979.<ref name="Staden"/> Prvi genom sekvenciran sačmarčnim sekvenciranjem bio je genom [[virus mozaika karfiola]], objavljeno 1981.<ref>{{Cite journal|last1=Gardner|first1=Richard C.|last2=Howarth|first2=Alan J.|last3=Hahn|first3=Peter|last4=Brown-Luedi|first4=Marianne|last5=Shepherd|first5=Robert J.|last6=Messing|first6=Joachim|date=25. 6. 1981|title=The complete nucleotide sequence of an infectious clone of cauliflower mosaic virus by M13mp7 shotgun sequencing|url= |journal=Nucleic Acids Research|language=en|volume=9|issue=12|pages=2871–2888|doi=10.1093/nar/9.12.2871|issn=0305-1048|pmid=6269062|pmc=326899}}</ref><ref>{{Cite journal|last=Doctrow|first=Brian|date=19. 7. 2016|title=Profile of Joachim Messing|journal=Proceedings of the National Academy of Sciences|language=en|volume=113|issue=29|pages=7935–7937|doi=10.1073/pnas.1608857113|issn=0027-8424|pmid=27382176|pmc=4961156|bibcode=2016PNAS..113.7935D |doi-access=free}}</ref>
 
=== Sekvenciranje uparenog kraja ===
Šira primjena imala je koristi od [[Teorija sekvenciranja DNK|uparivanja krajnjeg sekvenciranja]], kolokvijalno poznatog kao ''sekvenciranje sačmaricom sa dvostrukom cijevi''. Kako su projekti sekvenciranja počeli preuzimati duže i složenije sekvence DNK, više grupa je počelo shvaćati da se korisne informacije mogu dobiti sekvenciranjem oba kraja fragmenta DNK. Iako je sekvenciranje oba kraja istog fragmenta i praćenje uparenih podataka bilo glomaznije od sekvenciranja jednog kraja dva različita fragmenta, saznanje da su dvije sekvence orijentirane u suprotnim smjerovima i da su otprilike dužine fragmenta odvojeno od svakog drugi je bio vrijedan u rekonstrukciji sekvence originalnog ciljnog fragmenta.
 
'''Historija''':  Prvi objavljeni opis upotrebe sekvenciranja uparenih krajeva bio je u 1990.<ref>{{cite journal
  | last = Edwards
  | first = A
  |author2=Caskey, T
   | title = Closure strategies for random DNA sequencing
  | journal = Methods: A Companion to Methods in Enzymology
  | volume = 3
  | issue = 1
  | pages = 41–47
  | date = 1991
  | doi = 10.1016/S1046-2023(05)80162-8 }}</ref> kao dio sekvenciranja ljudskog [[HGPRT|hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaznoglokusa]], iako je upotreba uparenih krajeva bila ograničena na zatvaranje praznina nakon primjene tradicijskog pristupa nasumičnog sekvenciranja s. Prvi teorijski opis čiste strategije sekvenciranja krajova u paru, uz pretpostavku da su fragmenti konstantne dužine, bio je 1991. godine.<ref>{{cite journal
  | last = Edwards
  | first = A
  |author2=Voss, H. |author3=Rice, P. |author4=Civitello, A. |author5=Stegemann, J. |author6=Schwager, C. |author7=Zimmerman, J. |author8=Erfle, H. |author9=Caskey, T. |author10= Ansorge, W.
  | title = Automated DNA sequencing of the human HPRT locus
  | journal = Genomics
  | volume = 6
  | pages = 593–608
  | date = 1990
  | pmid = 2341149
  | doi = 10.1016/0888-7543(90)90493-E
  | issue = 4 }}
</ref>  U to vrijeme, postojao je konsenzus zajednice da bi optimalna dužina fragmenta za uparivanje krajnjeg sekvenciranja bila tri puta veća od dužine čitanja sekvence. 1995. [[Jared Roach|Roach]] et al.<ref>{{cite journal
  | last = Roach
  | first = JC
  | author2 = Boysen, C
  | author3 = Wang, K
  | author4 = Hood, L
  | title = Pairwise end sequencing: a unified approach to genomic mapping and sequencing
  | journal = Genomics
  | volume = 26
  | pages = 345–353
  | date = 1995
  | pmid = 7601461
  | doi = 10.1016/0888-7543(95)80219-C
  | issue = 2 }}</ref> uveli su inovaciju korištenja fragmenata različitih veličina i pokazao da je čisto u paru strategija krajnjeg sekvenciranja bila bi moguća na velikim ciljevima. Strategiju je naknadno usvojio [[Institut za genomska istraživanja]] (TIGR) za sekvenciranje genoma bakterije ''[[Haemophilus influenzae]]'' 1995.,<ref>{{cite journal
  | last = Fleischmann
  | first = RD
  | s2cid = 10423613
 | title = Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd
  | journal = Science
  | volume = 269
  | issue = 5223
  | pages = 496–512
  | date = 1995
  | pmid = 7542800
  | doi = 10.1126/science.7542800 |bibcode = 1995Sci...269..496F |display-authors=etal}}</ref> a zatim od strane [[Celera Genomics]] za sekvenciranje genoma ''[[Drosophila melanogaster]]'' (voćne mušice) 2000.,<ref>{{cite journal
 |last            = Adams
 |first           = MD
 |title           = The genome sequence of Drosophila melanogaster
 |journal         = Science
 |volume          = 287
 |issue           = 5461
 |pages           = 2185–95
 |date            = 2000
 |pmid            = 10731132
 |doi             = 10.1126/science.287.5461.2185
 |bibcode         = 2000Sci...287.2185.
 |display-authors = etal
 |url             = http://faculty.evansville.edu/be6/b4456/genomep/adams.pdf
 |citeseerx       = 10.1.1.549.8639
 |access-date     = 25. 10. 2017
 |archive-date    = 22. 7. 2018
 |archive-url     = https://web.archive.org/web/20180722001126/http://faculty.evansville.edu/be6/b4456/genomep/adams.pdf
 |url-status      = dead
}}</ref> and subsequently the human genome.
 
=== Pristup ===
Da bi se primijenila strategija, lanac DNK visoke molekulske težine se siječe na nasumične fragmente, odabrane veličine (obično 2, 10, 50 i 150 kb) i [[klon (genetika)|klon]]irane u odgovarajući [[vektorska DNK|vektor]]. Klonovi se zatim sekvenciraju sa oba kraja koristeći [[Sangerovsko sekvenciranje|metod završetka lanca]] dajući dvije kratke sekvence. Svaka sekvenca se naziva ''čitabje kraja'' ili ''čitaj 1 i čitaj 2''i dva čitanja iz istog klona nazivaju se ''[[oznaka uparenog kraja|spareni parovi]]''. S obzirom da metod prekida lanca obično može proizvesti samo čitanja dugačka između 500 i 1000 baza, u svim osim najmanjih klonova, upareni parovi će se rijetko preklapati.
 
=== Sklapanje ===
Originalna sekvenca je rekonstruisana iz čitanja pomoću softvera [[sequence assembly]]. Prvo, čitanja koja se preklapaju se skupljaju u duže kompozitne sekvence poznate kao ''kontigovi''. Kontigovi se mogu povezati zajedno u ''skele'' prateći veze između sparenih parova. Udaljenost između kontiga može se zaključiti iz njihovih pozicija ako je poznata prosječna dužina fragmenta biblioteke i ima uzak prozor odstupanja. Ovisno o veličini jaza između kontiga, mogu se koristiti različite tehnike za pronalaženje sekvence u prazninama. Ako je jaz mali (5–20 kb), onda je potrebna upotreba [[PCR|lančane polimerazne reakcije]] (PCR) za pojačavanje regije, nakon čega slijedi sekvenciranje. Ako je jaz velik (>20 kb), tada se veliki fragment klonira u posebne vektore kao što su [[bakterijski vještački hromosom]] (BAC) nakon čega slijedi sekvenciranje vektora.
 
=== Za i protiv ===
Zagovornici ovog pristupa tvrde da je moguće sekvencirati cijeli [[genom]] odjednom koristeći velike nizove sekvencera, što cijeli proces čini mnogo efikasnijim od tradicijskih pristupa. Kritičari tvrde da iako tehnika brzo sekvencira velike regione DNK, njena sposobnost da pravilno poveže ove regione je sumnjiva, posebno za genome sa regionima koji se ponavljaju. Kako programi [[sequence Assembly]] postaju sofisticiraniji i [[računar]]ska snaga postaje jeftinija, možda će biti moguće prevazići ovo ograničenje.
 
===Pokrivenost===
{{glavni|Pokrivenost (genetika)}}
Pokrivenost (dubina čitanja ili dubina) je prosječan broj čitanja koja predstavljaju dati [[nukleotid]] u rekonstruiranoj sekvenci. Može se izračunati iz dužine originalnog [[genom]]a (''G''), broja čitanja (''N'') i prosječne dužine čitanja (''L'') kao <math>N\times L/G</math>. Naprimjer, hipotetski genom sa 2.000 parova baza rekonstruiranih iz 8 čitanja sa prosječnom dužinom od 500 nukleotida imat će 2x redundantnost. Ovaj parametar također omogućava procjenu drugih veličina, kao što je postotak genoma pokrivenog čitanjima (ponekad se naziva i pokrivenost). Poželjna je visoka pokrivenost u nasumičnom sekvenciranju jer može prevladati greške u [[pozivanje baze|pozivanju baze]] i sklapanju. Predmet [[teorija sekvenciranja DNK]] bavi se odnosima takvih veličina.
 
Ponekad se pravi razlika između ''pokrića sekvence'' i ''fizičke pokrivenosti''. Pokrivenost sekvence je prosječan broj čitanja baze (kao što je gore opisano). Fizička pokrivenost je prosječan broj čitanja baza ili proširenja čitanja uparenih partnera.<ref name="MeyersonFig1">{{cite journal |last1= Meyerson |first1= M. |last2= Gabriel |first2= S. |last3= Getz |first3= G. |doi= 10.1038/nrg2841 |title= Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing |journal= Nature Reviews Genetics |volume= 11 |issue= 10 |pages= 685–696 |year= 2010 |pmid= 20847746|s2cid= 2544266 }}</ref>

==Hijerarhijsko nasumično sekvenciranje ==
[[Slika:Whole genome shotgun sequencing versus Hierarchical shotgun sequencing.png|thumb|U sekvenciranju cijelog genoma (gore), cijeli genom se nasumično siječe na male fragmente (odgovarajuće veličine za sekvenciranje) i zatim se ponovo sastavlja. U hijerarhijskom sačmaričnom sekvenciranju (dolje), genom se prvo razbija na veće segmente. Nakon što se zaključi redoslijed ovih segmenata, oni se dalje sijeku u fragmente odgovarajuće veličine za sekvenciranje.]]
 
Iako se nasumično sekvencioniranje u teoriji može primijeniti na genom bilo koje veličine, njegova direktna primjena na sekvenciranje velikih genoma (naprimjer, [[ljudski genom]]) bila je ograničena do kasnih 1990-ih, kada je tehnološki napredak učinio praktičnim rukovanje od ogromne količine složenih podataka uključenih u proces.<ref name="genome sequencing">Dunham, I. ''Genome Sequencing''. Encyclopedia of Life Sciences, 2005. {{doi|10.1038/npg.els.0005378}}</ref> Historijski gledano, vjerovalo se da je ovakvo sekvenciranje punih genoma ograničeno i samom veličinom velikih genoma i složenošću koju dodaje visoki postotak repetitivne DNK (veći od 50% za [[ljudski genom]]) prisutan u velikim genomima.<ref name="venter">Venter, J. C. "Shotgunning the Human Genome: A Personal View." Encyclopedia of Life Sciences, 2006.</ref> Nije bilo široko prihvaćeno da će sekvenca velikog genoma sačmaricama punog genoma pružiti pouzdane podatke. Iz ovih razloga, morale su se koristiti druge strategije koje su smanjile računarsko opterećenje sklopa sekvenci prije nego što se izvrši sačmarično sekvenciranje.<ref name="venter"/>
U hijerarhijskom sekvenciranju, poznatom i kao sekvenciranje odozgo prema dolje, genoma niske rezolucije [[mapiranje gena|fizička mapa]] se pravi prije stvarnog sekvenciranja. Iz ove mape se odabire minimalni broj fragmenata koji pokrivaju cijeli [[hromosom]] za sekvenciranje.<ref name="textbook">Gibson, G. and Muse, S. V. ''A Primer of Genome Science''. 3rd ed. P.84</ref> Na ovaj način je potrebna minimalna količina sekvenciranja i sklapanja visoke propusnosti.
 
Amplificirani genom se prvo siječe na veće komade (50–200 kb) i klonira u bakterijskog domaćina koristeći BAC ili [[P1-izvedeni vještački hromosom]] (PAC). Budući da je više kopija genoma nasumično izrezano, fragmenti sadržani u ovim klonovima imaju različite krajeve i sa dovoljno pokrivenosti (vidi odjeljak iznad) pronalaženje '''skele''' [[kontig|BAC kontiga]] koji pokriva cijeli genom je teorijski moguće. Ova skela zove se '''popločavanje putanje'''.
[[slika:Tiling path.png|thumb|BAC kontig koji pokriva čitavo genomsko područje od interesa čini putanju popločavanja.]]
Jednom kada je putanja popločavanja napravljena, pronađeni BAC-ovi koji formiraju ovu putanju se nasumično dijele na manje fragmente i mogu se sekvencirati korištenjem metoda sačmarice na manjem obimu.
 
Iako pune sekvence BAC kontiga nisu poznate, poznate su njihove orijentacije jedna u odnosu na drugu. Postoji nekoliko metoda za određivanje ovog redoslijeda i odabir BAC-ova koji čine putanju popločavanja. Opća strategija uključuje identifikaciju položaja klonova u odnosu jedan prema drugom, a zatim izbor najmanjeg broja klonova potrebnih za formiranje susjedne skele koja pokriva cijelo područje od interesa. Redoslijed klonova utvrđuje se određivanjem načina na koji se oni preklapaju.<ref name="genome map">Dear, P. H. ''Genome Mapping''. Encyclopedia of Life Sciences, 2005. {{doi|10.1038/npg.els.0005353}}.</ref> Klonovi koji se preklapaju mogu se identificirati na nekoliko načina. Mala radioaktivno ili hemijski označena sonda koja sadrži [[mjesto označeno sekvencom]] (STS) može se hibridizirati na mikromrežu na kojem se klonovi štampaju. Na ovaj način, svi klonovi koji sadrže određenu sekvencu u genomu su identificirani. Kraj jednog od ovih klonova se zatim može sekvencirati kako bi se dobila nova sonda i proces se ponovio metodom koji se zove hodanje po hromosomima.
 
Alternativno, [[BAC biblioteka]] može biti restrikcijski sažetak. Zaključuje se da se dva klona koji imaju nekoliko zajedničkih veličina fragmenata preklapaju jer sadrže više zajedničkih restrikcijskih mjesta na sličan način. Ovaj metod genomskog mapiranja naziva se restrikcijskim otiskom prsta jer identificira skup ograničenja mjesta sadržana u svakom klonu. Nakon što je pronađeno preklapanje između klonova i njihov redoslijed u odnosu na genom poznat, skela minimalnog podskupa ovih kontiga koja pokriva cijeli genom se sekvencira.
 
Budući da prvo uključuje kreiranje mape genoma niske rezolucije, hijerarhijsko sekvenciranje sačmaricama je sporije od sekvenciranja sačmaricama cijelog genoma, ali se manje oslanja na kompjuterske algoritme nego sekvenciranje sačmaricama cijelog genoma. Međutim, proces obimnog kreiranja BAC biblioteke i odabira putanje popločavanja čini hijerarhijsko sekvenciranje sačmarica sporim i radno intenzivnim. Sada kada je tehnologija dostupna i pouzdanost podataka demonstrirana,<ref name="venter"/> brzina i isplativost nasiumičnog sekvenciranja u cijelom genomu učinili su ga primarnim metodom za sekvenciranje genoma.

==Novije tehnologije sekvenciranja==
Klasično sekvenciranje sačmaricama bilo je zasnovano na Sangerovskom metodu sekvenciranja: ovo je bila najnaprednija tehnika za sekvencioniranje genoma od otprilike 1995-2005. Strategija sačmarice se i danas primjenjuje, međutim, koristeći druge tehnologije sekvenciranja, kao što su [[DNK sekvenciranje|sekvenciranje kratkog čitanja]] i [[sekvenciranje dugog čitanja]].
 
Kratko čitanje ili sekvenciranje "sljedeće generacije" proizvodi kraća čitanja (bilo gdje od 25 do 500 bp), ali mnogo stotina hiljada ili miliona čitanja u relativno kratkom vremenu (po redu jednog dana).<ref>{{cite journal
  | last = Karl
  | first = V
 | title = Next Generation Sequencing: From Basic Research to Diagnostics
  | journal = Clinical Chemistry
  | volume = 55
  | issue = 4
  | pages = 41–47
  | date = 2009
  | pmid = 19246620
  | doi = 10.1373/clinchem.2008.112789 |display-authors=etal| doi-access = free
  }}</ref>
Ovo rezultira velikom pokrivenošću, ali je proces sastavljanja mnogo računarski intenzivniji. Ove tehnologije su znatno superiornije od Sangerovskog sekvenciranja zbog velike količine podataka i relativno kratkog vremena potrebnog za sekvenciranje cijelog genoma.<ref>{{cite journal
  | last = Metzker
  | first = Michael L.
  | title = Sequencing technologies - the next generation
  | journal = Nat Rev Genet
  | volume = 11
  | issue = 1
  | pages = 31–46
  | date = 2010
  | pmid = 19997069
  | doi = 10.1038/nrg2626
  | url = http://jics.utk.edu/files/images/csure-reu/PDF-FINAL-POSTER/Taylor-Pierre.pdf
  | citeseerx = 10.1.1.719.3885
  | s2cid = 205484500
  | access-date = 6. 1. 2023
  | archive-date = 28. 1. 2023
  | archive-url = https://web.archive.org/web/20230128095015/https://www.jics.utk.edu/files/images/csure-reu/PDF-FINAL-POSTER/Taylor-Pierre.pdf
  | url-status = dead
  }}</ref>
 
== Metagenomsko nasumično sekvenciranje==
{{glavni|Metagenomika}}
Očitavanje dužine 400-500 [[bazni par|parova baza]] je dovoljno da se odredi [[vrsta]] ili soj [[organizam]]a odakle dolazi DNK, pod uslovom da je njegov genom već poznat, koristeći naprimjer [[k-mer|'' k''-mer baziran]] [[taksonomija|taksonomski klasifikatorski]] softver. Sa milionima čitanja sekvenciranja uzorka životne sredine sljedeće generacije, moguće je dobiti potpuni pregled bilo kog složenog mikrobioma sa hiljadama vrsta, kao što je [[crijevna flora]]. ]]]]Prednosti u odnosu na 16S [[rRNK]] [[amplikonsko sekvenciranje]] su: nije ograničena na [[bakterije]], klasifikacija na nivou sojeva gdje sekvenciranje amplikona dobiva samo rod i mogućnost izdvajanja cijelih gena i specificiranja njihove funkcije kao dijela metagenoma.<ref>{{cite journal
  | last1 = Roumpeka
  | first1 = Despoina D.
  | display-authors = et al
  | title = A review of bioinformatics tools for bio-prospecting from metagenomic sequence data
  | journal = Frontiers in Genetics
  | volume = 8
  | pages = 23
  | date = 2017
  | pmid = 28321234
  | pmc = 5337752
  | doi = 10.3389/fgene.2017.00023
 | doi-access = free
 }}</ref>
Osetljivost [[metagenom]]skog sekvenciranja čini ga atraktivnim izborom za [[kliničko metagenomsko sekvenciranje|kliničku upotrebu]].<ref>{{cite journal
  | last1 = Gu
  | first1 = Wei
  | display-authors = et al
  | title = Clinical Metagenomic Next-Generation Sequencing for Pathogen Detection
  | journal = Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease
  | volume = 14
  | pages = 319–338
  | date = 2018
  | pmid = 30355154
  | pmc = 6345613
  | doi = 10.1146/annurev-pathmechdis-012418-012751
 }}</ref>
Međutim, naglašava problem kontaminacije uzorka ili cjevovoda za sekvenciranje.<ref>{{cite journal
  | last1 = Thoendel
  | first1 = Matthew
  | display-authors = et al
  | title = Impact of contaminating DNA in whole genome amplification kits used for metagenomic shotgun sequencing for infection diagnosis
  | journal = Journal of Clinical Microbiology
  | volume = 55
  | issue = 6
  | pages = 1789–1801
  | date = 2017
  | pmid = 28356418
  | pmc = 5442535
  | doi = 10.1128/JCM.02402-16
 }}</ref>
 
==Također pogledajte==
*[[Kliničko metagenomsko sekvenciranje]]
*[[Teorija sekvenciranja DNK]]
 
==Reference==
{{Reflist|30em}}
 
===Dopunska literatura===
{{Refbegin}}
*{{cite web | title=Shotgun sequencing comes of age | work=The Scientist | url=http://www.the-scientist.com/news/20021231/06 | access-date=31. 12. 2002 | archive-date=14. 5. 2011 | archive-url=https://web.archive.org/web/20110514111214/http://www.the-scientist.com/news/20021231/06/ | url-status=dead }}
*{{cite web
| title=Shotgun sequencing finds nanoorganisms - Probe of acid mine drainage turns up unsuspected virus-sized Archaea
| work=SpaceRef.com
| date=22. 12. 2006
| url=http://www.spaceref.com/news/viewpr.html?pid=21532
| access-date=23. 12. 2006
| archive-date=15. 9. 2019
| archive-url=https://web.archive.org/web/20190915235531/http://www.spaceref.com/news/viewpr.html?pid=21532
| url-status=dead
}}
{{Refend}}
 
==Vanjski linkovi==
{{NCBI-handbook}}

[[Kategorija:Molekularna biologija]]
[[Kategorija:Sekvenciranje DNK]]
[[Kategorija:Biotehnologija]]
[[Kategorija:Metagenomika]]
[[Kategorija:Bioinformatika]]